以泰國T.W.Flegel教授以及臺灣羅竹芳教授為首的研究人員已經(jīng)公開(kāi)確定引起急性肝胰腺壞死?。╤epatopancreatic necrosis disease，AHPND）的那株特異性副溶血性弧菌的PCR快速檢測的方法，并且公布了檢測方法的PCR引物以及反應方法。

　　前言：

　　在泰國，實(shí)驗由Centex Shrimp (泰國瑪希隆大學(xué)杰出人才中心對蝦研究組)、瑪希隆大學(xué)公共衛生部和水產(chǎn)養殖企業(yè)研究中心部、水產(chǎn)科學(xué)研究院、農業(yè)大學(xué)等多名研究人員完成的。自2011以來(lái)，這項工作得到了農業(yè)研究發(fā)展機構、臺灣國家科學(xué)委員會(huì )等多個(gè)機構的資金支持。

　　2013年12月5日，研究人員通過(guò)獲得的基因序列的對比信息，參照對比信息可以測試不同的PCR檢測方法，他們花了近20天的時(shí)間來(lái)驗證不同的PCR檢測，并公布了他們認為最好的檢測方式。

PCR  操作：

　　預熱 : 94°C, 5min

　　PCR 25~30 cycles with：

　　變性 : 94°C, 30 sec

　　退火 : 60°C, 30 sec　

　　延伸 : 72°C, 60 sec　

　　后延伸 : 72°C, 10 min

　　擴增產(chǎn)物  : ~700 bp

　　AHPND 引物組1 (AP1)　

　　AP1F：- 5’- CCTTGGGTGTGCTTAGAGGATG -3’　　

　　AP1R：- 5’- GCAAACTATCGCGCAGAACACC -3’　

　　AP1擴增產(chǎn)物為700 bp

　　AHPND 引物組2 (AP2)　　

　　AP2F：- 5’- TCACCCGAATGCTCGCTTGTGG -3’　

　　AP2R：- 5’- CGTCGCTACTGTCTAGCTGAAG -3’

　　AP2擴增產(chǎn)物為700 bp

正文如下：

　　目前，養蝦業(yè)在亞洲的經(jīng)濟局勢非常嚴峻，由對蝦死亡和停止養蝦造成的經(jīng)濟損失非常大。我們相信及時(shí)公布檢測方法，降低AHPND暴發(fā)風(fēng)險的所獲得的收益，遠遠比從檢測產(chǎn)品中收到的專(zhuān)利費用以及我們研究所需要的費用要多。如果要申請專(zhuān)利，還需要推遲幾周甚至到幾個(gè)月的時(shí)間用來(lái)準備文件，以及準備足量的商業(yè)檢測試劑盒投入市場(chǎng)，以滿(mǎn)足市場(chǎng)需求。我們無(wú)法預測推遲幾天、幾周甚至幾個(gè)月里，將造成的潛在市場(chǎng)經(jīng)濟損失。

　　基于以上諸多因素，我們決定公開(kāi)AHPND的PCR檢測操作方法，允許這些信息更為廣泛、迅速的傳播，以減少暴發(fā)AHPND的風(fēng)險。

　　雖然我們已經(jīng)做了大量測試，但由于樣本數還是有限的，簡(jiǎn)單地說(shuō)，我們發(fā)現以下幾個(gè)情況：

　　1、這兩對引物檢測了68個(gè)樣品，兩對引物檢測67個(gè)樣本的檢測結果是一致的。

　　2、從糧農組織在越南用于研究宏基因組學(xué)分析收集的對蝦肝胰臟組織（每個(gè)池塘10蝦）的14個(gè)樣本中，其中8個(gè)樣品具有積極的AHPND病理特征，但PCR檢測結果顯示5個(gè)為陽(yáng)性結果3個(gè)為陰性結果（兩對引物檢測顯示結果）;而5個(gè)樣品的AHPND病理特征不明顯的，兩對引物PCR檢測結果均為陰性結果。

　　3、68個(gè)測試樣本中分理出5株副溶血弧菌的AHPND樣本中，并通過(guò)生物鑒定都可以導致AHPND病變，其中有3個(gè)樣品是在2002年在對蝦底泥中分離得到的弧菌，并被證實(shí)并不會(huì )引起暴發(fā)AHPND（兩對引物檢測結果顯示呈陰性），另外2株在水體及蝦體取得的樣本，尚未進(jìn)行生物測試。

　　4、有一個(gè)弧菌生物測定不會(huì )導致AHPND的組織病理，但是養殖過(guò)程中的卻造成高死亡率并伴隨著(zhù)肝胰腺組織病變癥狀，兩對引物PCR檢測結果均為陽(yáng)性。

　　5、新分離的瓦氏菌（Shewanella）、紅球菌（Rhodococcus）、賴(lài)氏細菌（Leifsonia）、戴爾福特菌（ Delftia）、青枯菌（Ralstonia）、創(chuàng )傷弧菌（V. vulnificus）、哈維氏弧菌（ V. harveyi）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）和枯草芽孢桿菌（B. subtilis）的兩對引物檢測結果為陰性。

　　至此，我們不能保證所闡述的方法與每個(gè)可能的非AHPND細菌的樣本或者其它有機體沒(méi)有交叉反應。我們也不能保證這種方法能檢測出每一株可能引起對蝦AHPND的細菌。我們也邀請所有行業(yè)人員，幫助我們進(jìn)行進(jìn)一步的驗證、改進(jìn)這個(gè)檢測方法。

　　我們初步的序列拼接和序列比較分析表明，我們已經(jīng)確定了的目標序列來(lái)自細菌的質(zhì)粒DNA并不是來(lái)自于A(yíng)HPND菌株的染色體DNA。如果這個(gè)假設被證實(shí)，這也將影響AHPND有關(guān)的毒力傳導機制。然而確定毒素所需的時(shí)間目前還無(wú)法確定。由于情況緊急，我們決定發(fā)布PCR檢測引物序列信息，它將作為一個(gè)臨時(shí)檢測工具，直到毒素被確定。