以泰國T.W.Flegel教授以及臺灣羅竹芳教授為首的研究人員已經(jīng)公開(kāi)確定引起急性肝胰腺壞死?。╤epatopancreatic necrosis disease,AHPND)的那株特異性副溶血性弧菌的PCR快速檢測的方法,并且公布了檢測方法的PCR引物以及反應方法。
前言:
在泰國,實(shí)驗由Centex Shrimp (泰國瑪希隆大學(xué)杰出人才中心對蝦研究組)、瑪希隆大學(xué)公共衛生部和水產(chǎn)養殖企業(yè)研究中心部、水產(chǎn)科學(xué)研究院、農業(yè)大學(xué)等多名研究人員完成的。自2011以來(lái),這項工作得到了農業(yè)研究發(fā)展機構、臺灣國家科學(xué)委員會(huì )等多個(gè)機構的資金支持。
2013年12月5日,研究人員通過(guò)獲得的基因序列的對比信息,參照對比信息可以測試不同的PCR檢測方法,他們花了近20天的時(shí)間來(lái)驗證不同的PCR檢測,并公布了他們認為最好的檢測方式。
PCR 操作:
預熱 : 94°C, 5min
PCR 25~30 cycles with:
變性 : 94°C, 30 sec
退火 : 60°C, 30 sec
延伸 : 72°C, 60 sec
后延伸 : 72°C, 10 min
擴增產(chǎn)物 : ~700 bp
AHPND 引物組1 (AP1)
AP1F:- 5’- CCTTGGGTGTGCTTAGAGGATG -3’
AP1R:- 5’- GCAAACTATCGCGCAGAACACC -3’
AP1擴增產(chǎn)物為700 bp
AHPND 引物組2 (AP2)
AP2F:- 5’- TCACCCGAATGCTCGCTTGTGG -3’
AP2R:- 5’- CGTCGCTACTGTCTAGCTGAAG -3’
AP2擴增產(chǎn)物為700 bp
正文如下:
目前,養蝦業(yè)在亞洲的經(jīng)濟局勢非常嚴峻,由對蝦死亡和停止養蝦造成的經(jīng)濟損失非常大。我們相信及時(shí)公布檢測方法,降低AHPND暴發(fā)風(fēng)險的所獲得的收益,遠遠比從檢測產(chǎn)品中收到的專(zhuān)利費用以及我們研究所需要的費用要多。如果要申請專(zhuān)利,還需要推遲幾周甚至到幾個(gè)月的時(shí)間用來(lái)準備文件,以及準備足量的商業(yè)檢測試劑盒投入市場(chǎng),以滿(mǎn)足市場(chǎng)需求。我們無(wú)法預測推遲幾天、幾周甚至幾個(gè)月里,將造成的潛在市場(chǎng)經(jīng)濟損失。
基于以上諸多因素,我們決定公開(kāi)AHPND的PCR檢測操作方法,允許這些信息更為廣泛、迅速的傳播,以減少暴發(fā)AHPND的風(fēng)險。
雖然我們已經(jīng)做了大量測試,但由于樣本數還是有限的,簡(jiǎn)單地說(shuō),我們發(fā)現以下幾個(gè)情況:
1、這兩對引物檢測了68個(gè)樣品,兩對引物檢測67個(gè)樣本的檢測結果是一致的。
2、從糧農組織在越南用于研究宏基因組學(xué)分析收集的對蝦肝胰臟組織(每個(gè)池塘10蝦)的14個(gè)樣本中,其中8個(gè)樣品具有積極的AHPND病理特征,但PCR檢測結果顯示5個(gè)為陽(yáng)性結果3個(gè)為陰性結果(兩對引物檢測顯示結果);而5個(gè)樣品的AHPND病理特征不明顯的,兩對引物PCR檢測結果均為陰性結果。
3、68個(gè)測試樣本中分理出5株副溶血弧菌的AHPND樣本中,并通過(guò)生物鑒定都可以導致AHPND病變,其中有3個(gè)樣品是在2002年在對蝦底泥中分離得到的弧菌,并被證實(shí)并不會(huì )引起暴發(fā)AHPND(兩對引物檢測結果顯示呈陰性),另外2株在水體及蝦體取得的樣本,尚未進(jìn)行生物測試。
4、有一個(gè)弧菌生物測定不會(huì )導致AHPND的組織病理,但是養殖過(guò)程中的卻造成高死亡率并伴隨著(zhù)肝胰腺組織病變癥狀,兩對引物PCR檢測結果均為陽(yáng)性。
5、新分離的瓦氏菌(Shewanella)、紅球菌(Rhodococcus)、賴(lài)氏細菌(Leifsonia)、戴爾福特菌( Delftia)、青枯菌(Ralstonia)、創(chuàng )傷弧菌(V. vulnificus)、哈維氏弧菌( V. harveyi)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)和枯草芽孢桿菌(B. subtilis)的兩對引物檢測結果為陰性。
至此,我們不能保證所闡述的方法與每個(gè)可能的非AHPND細菌的樣本或者其它有機體沒(méi)有交叉反應。我們也不能保證這種方法能檢測出每一株可能引起對蝦AHPND的細菌。我們也邀請所有行業(yè)人員,幫助我們進(jìn)行進(jìn)一步的驗證、改進(jìn)這個(gè)檢測方法。
我們初步的序列拼接和序列比較分析表明,我們已經(jīng)確定了的目標序列來(lái)自細菌的質(zhì)粒DNA并不是來(lái)自于A(yíng)HPND菌株的染色體DNA。如果這個(gè)假設被證實(shí),這也將影響AHPND有關(guān)的毒力傳導機制。然而確定毒素所需的時(shí)間目前還無(wú)法確定。由于情況緊急,我們決定發(fā)布PCR檢測引物序列信息,它將作為一個(gè)臨時(shí)檢測工具,直到毒素被確定。